双酶切,然后做ligase连接就好.连接的过程中会出现很多突变. 　　然后你把连接的产物做转化.如果有条件可以使用电激转化,这个转化的效率非常点（连接产物本来就不多,突变又多）.如果条件不够就用热激转化,热激转化的效率低一些,不如电激转化好.千万不要用TSS转化（效率太低了,只能用成型的质粒）. 　　转化之后你要挑选菌落,去做测序（一般交给公司）,因为突变很多,一定要测序到完全正确的序列.如果没有测到,就继续挑选菌落.如果菌落挑完了,就重新转化.这段时间要多扶老太太过马路哦. 　　等到你得到了好的菌落,就可以培养它,提取质粒.这个量就很大了. 　　给你个简单的protocol 　　PCR你的基因 　　对PCR产物,和空质粒,同时使用双酶切（分开的）,加入合适的NEBuffer 　　使用T4ligase和Buffer常温1小时或者16度过夜连接. 　　热激转化（电激转化还有clean脱盐） 　　挑去菌落 　　提取DNA测序（（（得到了你要的哦））） 　　选定菌落,液氮保存