问题标题：
14kd的westernblot我做的蛋白分子量为14.4kd,用的是15%的分离胶,100V电泳一小时,5%BSA封闭一小时,一抗（1：200)4度过夜,TBST洗膜四次,每次十分钟.二抗（1：5000）室温一小时,经洗膜显色,背景较深,等
问题描述：
14kd的westernblot
我做的蛋白分子量为14.4kd,用的是15%的分离胶,100V电泳一小时,5%BSA封闭一小时,一抗（1：200)4度过夜,TBST洗膜四次,每次十分钟.二抗（1：5000）室温一小时,经洗膜显色,背景较深,等荧光变弱时也没有任何条带出现
一抗为santa公司的,
请各位大虾给点建议
李向欣回答：
1.可能是样品的浓度低,可以增加上样浓度（不要增加太多的上样量).
2.可能是分子量太小跑丢了,可以增加分离胶的浓度,或者缩短电泳的时间.
3.二抗以后用什么洗的膜?只用的TBST吗?我都是用TBST洗几遍再用TBS(去掉吐温的TBST)洗.
试试吧,多做几次就知道了,生物实验有时候不稳定的.
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