问题标题:
【大肠杆菌cacl2处理】
问题描述:
大肠杆菌cacl2处理
孙英达回答:
你是要问处理的目的还是要做感受态细胞的过程啊
下面是做感受态细胞的过程:
1.从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中.于37℃振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4.
2.在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,冰上放置10~20min.
3.于4℃4000转/分离心10min,回收细菌细胞.
4.将管倒置1min,以使最后残留的痕量培养液流尽.
5.以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上,4℃4000转/分离心10min,回收细菌细胞.
6.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用.
7.用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200μl转移到无菌的微量离心管中,加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻旋以混匀内容物,冰浴30min.
8.将离心管放到预加温到42℃的水浴中,90s.
9.将混合物快速转移到冰浴中,冷却1~2分钟,加入适当的培养基在37℃培养45分钟,使细胞复苏,并表达质粒所携带的转化基因.
10.将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的平板培养基上.
11.将平板置于室温至液体被吸收,倒置平板于37℃培养箱中,12~16h,平板培养,克隆在此期间应该出现,否则转化不成功.
点击显示
生物推荐
热门生物推荐