PCR是DNA的体外扩增技术. 　　DNA复制是有生命力的细胞在体内自我复制的过程,属于体内扩增. 　　PCR(聚合酶链式反应)原理 　　PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链.这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子.如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25～30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106～107倍. 　　DNA复制过程: 　　(一)复制的起始 　　1.螺旋的松弛与解链 　　⑴拓扑异构酶---能改变DNA空间构像的酶 　　作用：DNA复制时松弛超螺旋,以利复制叉的行进及DNA合成,合成后再引向超螺旋. 　　功能：不清楚,可催化体外拓扑异构化反应,拓扑异构酶分两型. 　　拓扑异构酶I（topoisomerase--I） 　　作用：松弛超螺旋,不需ATP,作用机制：切开环状一条链、打结与解结 　　原核：拓扑异构酶I对负超螺旋作用>正超螺旋 　　真核：拓扑异构酶I对正、负超螺旋均有作用. 　　拓扑异构酶Ⅱ---旋转酶（gyrase） 　　作用：松弛超螺旋,作用机制：切开环状两条链、打结与解结、环连与解环连 　　⑵解链酶（helicase）---复制蛋白rep 　　作用：ATP供能时,解开DNA双链. 　　原核：编码解链酶的基因是dnaB.前导链结合rep蛋白,随从链结合解链酶II、Ⅲ 　　⑶单链结合蛋白（SSB） 　　作用：SSB与解开DNA单链结合,保护稳定DNA.与新复制DNA单链结合,以防其降解. 　　螺旋松弛与解链过程如图所示 　　2.引发 　　⑴引物酶（primase） 　　作用：以DNA为模板,自5'→3'合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸,3'末端为-OH. 　　原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶. 　　⑵引发前体（preprimosome） 　　由多种蛋白因子组成复合物. 　　作用：合成RNA引物,沿随从链复制叉的行进方向移动,在不同部位,合成RNA引物. 　　小结：合成RNA引物,在引物3'-OH末段进行DNA片段合成. 　　二DNA链的延长 　　反应体系：DNA模板,DNA聚合酶,dNTP,引物,Mg2+ 　　反应式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppi 　　真核与原核中DNA聚合酶（DNApolymorase-DNApol）： 　　有几种类型,作用方式相同,但各具特性及功能. 　　1.大肠杆菌DNA聚合酶（3种） 　　⑴polI：催化5'→3'的聚合作用,合成20个核苷酸即离开模板,填充空隙. 　　3'→5'外切酶活性,去除错误碱基,有校对作用. 　　5'→3'外切酶活性,去除RNA引物及修正错误碱基. 　　⑵polII：催化5'→3'DNA合成并具有3'→5'外切酶活性,体内功能不清楚. 　　⑶polⅢ:DNA链延长起主要作用,细菌中以1000dNTP/秒进行聚合反应. 　　3'→5'外切酶活性,校对作用,与polI配合使错误率降至10-6.如图所示 　　DNA复制的保真性：遵守严格的碱基配对规律.-聚合酶对碱基的选择功能.聚合酶对错误碱基的校读作用.以上三种作用确保了DNA复制的准确性. 　　2、真核生物DNA聚合酶 　　特性与大肠杆菌相似,共五种：α、β、γ、δ、ε 　　⑴polδ：催化前导链及随从链的合成,需增殖细胞核抗原蛋白PCNA的参与. 　　⑵polα：与引发酶配合,参与随从链的合成. 　　⑶RFA（replicationfactorA）：DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用. 　　三终止 　　连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3',5'磷酸二酯键相连,需ATP供能.