革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚,经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小,结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄,脂肪含量高,经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态,细胞壁孔径大,不能阻止溶剂透入,因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色.虽然如此,革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别,也因物理结构不同结果不同,例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同,但具有革兰染色阳性反应.