A、反转录酶能催化反转录过程，但其作用部位不是磷酸二酯键，A错误； 　　B、RNA聚合酶的作用是催化转录形成RNA，能形成RNA上的磷酸二酯键，而限制酶是作用于DNA上的磷酸二酯键，B错误； 　　C、DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，作用于与限制性核酸内切酶相对的部位，C正确； 　　D、DNA解旋酶能解开双链DNA，破坏的是碱基对之间的氢键，D错误． 　　故选：C．